Fils d'un cordonnier et d'une couturière, Giuseppe Puglisi entre en 1953 au séminaire diocésain de Palerme, et est ordonné prêtre par le cardinal Ernesto Ruffini. En 1961, il est nommé vicaire à la paroisse du Saint Sauveur dans le canton de Settecannoli, et est nommé recteur de l'église Saint-Jean des Lépreux. De 1970 à 1978, il est curé de Godrano, près de Palerme, dans un village marqué par une vendetta sanglante ; il y prêche le pardon aux familles belligérantes.
En 1992, il devient directeur spirituel du séminaire de Palerme et dirige des mouvements d'évangélisation. Son attention se tournera progressivement vers le recrutement des jeunes par la Mafia.
Alors qu'il était, depuis 1990, curé de la paroisse de San Gaetano dans le quartier palermitain de Brancaccio, il est abattu en pleine rue d'une balle dans la nuque. Son assassinat a été commandité par des chefs mafieux, condamnés depuis à la prison à perpétuité.
Par son travail social, il avait gêné les chefs locaux, en les privant d'une partie de "leur" main d'œuvre enfantine. Il avait refusé de confier l'organisation des fêtes religieuses aux notables locaux, organisation qui aurait permis aux mafieux de trouver des financements, et brisait ainsi la soumission des habitants.